เครื่องมือ สำคัญ ในการศึกษา ความ ผันแปร ทางพันธุกรรม ด้วย เทคนิค RFLP คือ ข้อ ใด

เนื่องจากการดูลายพิมพ์ดีเอ็นเอหรือ STR ต้องใช้ดีเอ็นเอในปริมาณมาก จึงเป็นข้อจำกัดในการใช้งานทางนิติเวชศาสตร์ ซึ่งมีปริมาณดีเอ็นเอน้อย หรือมีแบคทีเรีย ปนเปื้อนในตัวอย่างที่ส่งมาตรวจด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (Polymerase chain reaction ; PCR - ขบวนการสังเคราะห์ชิ้นส่วนดีเอ็นเอในหลอดทดลองซึ่งเลียนแบบขบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต)

PCR ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอทำให้สามารถใช้ในงานทางนิติเวชศาสตร์ได้ ส่วนของดีเอ็นเอที่นิยมใช้ในการพิสูจน์บุคคล ได้แก่ Minisatellite DNA Region ที่มีการเรียงตัวซ้ำกันของเบสจำนวนตั้งแต่ 14-70 เบส และ Microsatellite DNA Region ที่มีการเรียงตัวซ้ำกันของเบสจำนวนตั้งแต่ 2-6 เบส ผลิตผลที่ได้จากการสร้างลายพิมพ์ ดีเอ็นเอจะมีขนาดตั้งแต่ 100-1000 เบส โดยที่มีความน่าจะเป็นน้อยมากที่บุคคล 2 คน จะมีลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เหมือนกันทุกประการ หรือไม่มีโอกาสเลย ยกเว้นแต่เฉพาะในฝาแฝดที่เกิดมาจากไข่ใบเดียวกันเท่านั้น รูปแบบลายพิมพ์ดีเอ็นเอนำไปใช้ในการพิสูจน์ความเป็นพ่อแม่ ลูก การนำไปสืบหาฆาตกรในคดีความต่างๆ ที่ผู้ต้องสงสัยทิ้งคราบเลือด หรือ คราบอสุจิ การติดตามผลการรักษาการปลูกถ่ายไขกระดูกในคนไข้ที่เป็นโรคมะเร็ง นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้ในการสนับสนุนการตรวจสอบความถูกต้องตามกฎหมาย เช่น การพิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือดเพื่อเปลี่ยนจากสัญชาติอื่น มาเป็นสัญชาติไทย ตามกฎหมายตรวจคนเข้าเมือง เป็นต้น การเก็บเยื่อเยื่อเพื่อนำมาศึกษานิยมขูดเยื่อบุกระพุ้มแก้ม ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ได้จากการสร้างโดยใช้เทคนิค PCR จะมีลักษณะเป็นแถบดีเอ็นเอ เพียง 1-2 แถบต่อการสร้าง 1 โลกัส (locus -ตำแหน่งหนึ่งๆ บนยีนหรือลำดับดีเอ็นเอบนโครโมโซม)

การพิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือดอาศัยหลักการที่ว่ามนุษย์ทุกคนจะมีสารพันธุกรรม (ดีเอ็นเอ ; DNA – Deoxyribonucleic acid) ที่ได้รับการถ่ายทอดมาจากพ่อและแม่ โดยจะต้องได้รับสารพันธุกรรมจากพ่อและแม่อย่างละครึ่งดีเอ็นเอของคนทุกๆ คนจะไม่เหมือนกัน แต่ละคนจะมีดีเอ็นเอที่เป็นเอกลักษณ์ของตนเองแม้พี่น้องที่เกิดจากพ่อแม่ เดียวกัน ยกเว้นในกรณีของฝาแฝดแท้ซึ่งเกิดจากไข่ใบเดียวกัน จึงจะมีดีเอ็นเอเหมือนกันทุกประการ สารพันธุกรรม (DNA) พบในเซลล์เกือบทุกเซลล์ของสิ่งมีชีวิต มีอยู่ในนิวเคลียสของเซลล์และพบในไมโตคอนเดรีย (Mitochondria) ในการปฏิสนธีที่ผสมกันระหว่างสเปิร์ม (sperms) กับเซลล์ไข่ (ovum) เริ่มจากสเปิร์มสัมผัสกับชั้นที่ห่อหุมเซลล์ไข่ (jelly coat) จากนั้นอะโครโซม (acrosome-ผนังส่วนหัวของสเปิร์ม) จะปล่อยเอนไซม์ออกมาย่อยสลายชั้นนี้ จากนั้นสเปิร์มจะมาถึงชั้นวิเทลไลน์ (vitelline) ซึ่งจะมีตัวรับ (receptor) จดจำเฉพาะสปีชีส์เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการปฏิสนธิข้ามสายพันธุ์ กลไกนี้มีความสำคัญมากในสัตว์ที่ปฏิสนธิภายนอก ส่วนสเปิร์มที่เข้าไปในไข่แล้วจะสลัดส่วนหาง (axoneme) ทิ้งไป

ดังนั้นไมโตคอนเดรียลดีเอ็นเอ (DNA mitochondria) ของพ่อจึงไม่ถ่ายทอดไปยังลูก ส่วนหัวที่เข้าไปในไข่จะเริ่มพองขึ้นและเยื่อหุ้มเซลล์ของไข่และสเปิร์มจะหลอมรวมกันนิวเคลียสของสเปิร์มเข้าไปในไซโทพลาสซึมของไข่ เยื่อหุ้มเซลล์ของไข่จะเกิดการเปลี่ยนแปลงเพื่อป้องกันไม่ให้สเปิร์มตัวอื่นเข้ามาปฏิสนธิได้อีก โดยชั้นวิเทลไลน์จะแข็งตัวและแยกต่างหากออกจากเยื่อหุ้มเซลล์ไข่กลายเป็นเยื่อหุ้มหลังปฏิสนธิ (fertilization envelope) นิวเคลียสของไข่และของสเปิร์มจะรวมตัวกันกลายเป็นนิวเคลียสของไซโกตที่มีสารพันธุกรรมเป็น 2n ในปัจจุบันการตรวจพิสูจน์บุคคลด้วยไมโทคอนเดรียลดีเอ็นเอนั้น ทําการตรวจในบริเวณที่เรียกว่าบริเวณควบคุม (control region) ซึ่งพบว่าไมโตคอนเดรียลดีเอ็นเอไม่มีการรวมกลุ่มของยีนใหม่ (recombination) มีความหลากหลายสูงและมีการสะสมของการเกิดการกลายพันธุ์ (mutation) หรือความแปรผันของลำดับเบส (mutation rate) มากกว่าดีเอ็นเอในนิวเคลียสถึง 10 เท่า ประมาณ 0.32 ต่อ หนึ่ง base pair ต่อ หนึ่งล้านปี และในส่วนอื่นของจีโนมไมโทคอนเดรีย ประมาณ 0.02 ต่อหนึ่ง base pair ต่อหนึ่งล้านปี

อัตราการกลายพันธ์ที่สูงของจีโนมในไมโทคอนเดรียเกิดจากการแทนที่ของเบสเพียง 1 ตัว มากกว่าการเพิ่ม (insertion) หรือการลดจํานวนเบส (deletion) ไมโตคอนเดรียลดีเอ็นเออยู่ในออร์แกนแนลที่เรียกว่า ไมโตคอนเดรีย ซึ่งจะมีลักษณะเป็นวงกลม 2 สายพันกัน สายที่มีเบสเพียวรีน (purine) มากเรียกว่า H-strand และอีกสายที่มีเบสไพริมิดีน (pyrimidine) มากเรียกว่า L- strand มีความยาวลำดับเบสทั้งหมด 16,569 คู่เบส และทำการถอดรหัสยีนเพื่อใช๎ในกระบวนการหายใจระดับเซลล์ทั้งหมด 37 ยีน ไมโตคอนเดรียดดีเอ็นเอพบได้มากภายในเซลล์ สามารถถยทอดจากแม่สู่ลูก (maternal inheritance) ทำให้ที่มีความสัมพันธ์ทางสายโลหิตฝ่ายแม่ จะมีรหัสพันธุกรรมของไมโตคอนเดรียลดีเอ็นเอเหมือนกัน

เครื่องหมายดีเอ็นเอ

โดย :

นายอนุรุทธิ์ หมีดเส็น

เมื่อ :

วันอาทิตย์, 21 พฤษภาคม 2560

เทคโนโลยีดีเอ็นเอ

เทคโนโลยีดีเอ็นเอ เป็นเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์ที่กำลังมีบทบาทสำคัญในการเกษตร โดยเฉพาะในงานปรับปรุงพันธุ์พืช ซึ่งถือว่าเป็นหัวใจสำคัญในการสร้างพืชพันธุ์ใหม่ ให้มีลักษณะดีตรงตามความต้องการของตลาด และมีผลผลิตสูงเป็นที่ต้องการของผู้ปลูก กระบวนการปรับปรุงพันธุ์พืช เป็นงานที่รวมทั้งศาสตร์และศิลป์เข้าด้วยกัน โดยอาศัยความพยายามของ นักปรับปรุงพันธุ์พืช ที่จะรวบรวมลักษณะทางพันธุกรรมที่ดีเด่นจากแหล่งต่าง ๆ มา สร้างพืชพันธุ์ใหม่ โดยใช้กระบวนการ คัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ที่เหมาะสม งานปรับปรุงพันธุ์พืช จึงมีความจำเป็นต้องใช้เครื่องมือที่มีความแม่นยำในการคัดเลือกและแยกความแตกต่างของลักษณะที่แสดงออกของแต่ละสายพันธุ์ ดังนั้นเครื่องหมายดีเอ็นเอ จึงเข้ามามีบทบาทมากขึ้น เพราะเป็นการคัดเลือกพืชจากจีโนไทป์โดยตรง

เครื่องหมายทางพันธุกรรม หมายถึง ลักษณะหรือตัวบ่งชี้ที่มีความเฉพาะเจาะจง สามารถนำมาใช้แยกความแตกต่างทาง พันธุกรรม และสามารถถ่ายทอดลักษณะนั้นๆไปยังรุ่นลูกได้ เครื่องหมายทางพันธุกรรมที่มีการใช้กันมานานแล้วในงานปรับปรุงพันธุ์พืช ได้แก่ การใช้ลักษณะรูปพรรณสัณฐานพืชที่มีความแตกต่างกันมาใช้เป็นเครื่องหมาย เช่น ความสูง ลักษณะทรงพุ่ม สีของลำต้น ขนาด รูปร่างและสีของเมล็ด อายุวันออกดอก และวันเก็บเกี่ยว เป็นต้น โดยเรียกเครื่องหมายบ่งชี้นี้ว่า

“เครื่องหมายทางสัณฐานวิทยา” (morphological markers)อย่างไรก็ตาม พบว่าลักษณะดังกล่าวมักผันแปรไปตามสภาพ แวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงไป ทำให้เกิดความผิดพลาดในการแยกความแตกต่างของ สายพันธุ์ได้ นอกจากนั้นแล้ว การเปรียบเทียบลักษณะภายนอกนี้ ยังไม่สามารถแยกความแตกต่างของสายพันธุ์พืชบางชนิด ที่มีความ

ใกล้ชิดทางพันธุกรรมได้ ดังนั้น จึงจำเป็นต้องหาเครื่องบ่งชี้ชนิดอื่นมาประกอบ เพื่อช่วยให้การจำแนกความแตกต่างของ สายพันธุ์มีความถูกต้อง ต่อมาได้มีการพัฒนาเครื่องหมายโปรตีน

(protein marker)เช่น ไอโซไซม์(isozyme)เข้ามาช่วยในการบ่งชี้ความแตกต่างของสายพันธุ์พืช(varietal identification)โดยใช้ความแตกต่างของโมเลกุลโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของพืชมาตรวจสอบ ตัวอย่างเช่น การตรวจสอบรูปแบบขององค์ประกอบโปรตีนของเอนไซม์บางชนิดและโปรตีนที่สะสมในเมล็ดพืช เครื่องหมายโปรตีนถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของสายพันธุ์พืชในธุรกิจเมล็ดพันธุ์ เนื่องจากค่าใชจ่ายไม่สูงมากนัก อย่างไรก็ตาม เครื่องหมายโปรตีนยังมีข้อจำกัดที่สำคัญ คือ จำนวนยีนที่ใช้ตรวจสอบยังมีไม่มากนัก และยีนที่นำมาศึกษาต้องมีการแสดงออก(gene expression)ด้วย การตรวจสอบจึงจำเป็นต้องเลือกเนื้อเยื่อพืชและระยะการเจริญเติบโตที่เหมาะสม โดยคำนึงถึงการแสดงออกของยีนที่ต้องการตรวจสอบ นอกจากนั้น ผลการตรวจสอบยังขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมอีกด้วย ทำให้โอกาสการตรวจพบความแตกต่างในระดับโปรตีนมีค่าต่ำกว่าที่เป็นจริง จากข้อจำกัดดังกล่าว ทำให้นัก-วิทยาศาสตร์พยายามค้นหาและพัฒนาเทคนิคใหม่ๆมาใช้เป็นเครื่องหมายบ่งบอกภาพมากกว่าเครื่องหมายพันธุกรรมดังกล่าว ประกอบกับความก้าวหน้าทางด้านเทคโนโลยีดีเอ็นเอที่มีการพัฒนาอย่างรวดเร็วและต่อเนื่องในช่วง20ปีที่ผ่านมา ได้เปิดเผยความลี้ลับของรหัสพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต และมีการศึกษาวิจัยและพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลที่ใช้ บ่งบอกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิตในระดับสารพันธุกรรม(genetic material)หรือ ดีเอ็นเอ ได้อย่างมีประสิทธิภาพความแตกต่างของสายพันธุ์พืชที่มีประสิทธิ

Return to contents

เครื่องหมายดีเอ็นเอ(DNA Markers)หมายถึง ลำดับเบสช่วงหนึ่งของดีเอ็นเอที่ใช้เป็นเครื่องหมายบ่งชี้ความเป็นเอกลักษณ์ของสิ่งมีชีวิต โดยอาจมีตำแหน่งบนโครโมโซม ในนิวเคลียส(nuclear DNA)หรือใน ออร์แกเนลล์(mitochondria DNAหรือchloroplast DNA)และสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นลูกได้ พืชแต่ละชนิดแต่ละสายพันธุ์ มีการจัดเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลของดีเอ็นเอที่เป็นเอกลักษณ์ ความแตกต่างหรือโพลีมอร์ฟิซึมการใช้ดีเอ็นเอเป็นเครื่องหมายในการบ่งบอกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิต สามารถทำได้โดยการเปรียบเทียบลักษณะของดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตนั้นๆ โดยเทคนิคทางอณูวิทยา ซึ่งเป็นที่รู้จักกันโดยทั่วไปว่า(polymorphisms)ของลำดับเบสในโมเลกุลของดีเอ็นเอนี่เอง ที่ทำให้สิ่งมีชีวิตมีความแตกต่างกัน และสามารถนำมาประยุกต์ใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุลได้“ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ” (DNA Fingerprinting)ซึ่งความแตกต่างที่เกิดขึ้น หมายถึง แบบแผนดีเอ็นเอที่จำเพาะของสิ่งมีชีวิตหนึ่งๆ นั่นเอง สามารถนำมาตรวจสอบความแตก-ต่างหรือโพลีมอร์ฟิซึมของสิ่งมีชีวิตหรือสายพันธุ์พืชที่ต้องการตรวจสอบได้

Return to contents

ประเภทของเครื่องหมายดีเอ็นเอ

เครื่องหมายดีเอ็นเอ สามารถแบ่งออกเป็นประเภทใหญ่ๆ ได้

1. Hybridization-based marker

2ประเภท คือเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ ซึ่งพัฒนาขึ้นโดยอาศัยหลักการเข้าคู่ของลำดับเบสดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันระหว่างดีเอ็นเอตรวจสอบ(probe)กับดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจสอบ โดยใช้เทคนิคไฮบริไดเซชัน(hybridization)ตัวอย่างได้แก่ เครื่องหมายอาร์เอฟแอลพี

(RFLP marker )

Return to contents

เทคนิคพีซีอาร์เป็นเทคนิคการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอในหลอดทดลอง ค้นพบโดย Kary Mullis ในปี ค.ศ. 1980 เทคนิคนี้เป็นการจำลองดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต โดยอาศัยเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทนต่ออุณหภูมิสูงและสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ต้องการเป็นจำนวนมาก ภายในเวลาเพียง 2 – 3 ชั่วโมง เทคนิคพีซีอาร์มี 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอเป็นสายเดี่ยว (denaturation) เป็นขั้นตอนที่ดีเอ็นเอต้นแบบถูกทำให้แยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว 2 สาย เพื่อเปิดโอกาสให้ไพรเมอร์เข้าไปจับกับบริเวณที่ต้องการเพิ่มปริมาณบนสายดีเอ็นเอต้นแบบ ขั้นตอนการจับของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอต้นแบบ (annealing) เป็นขั้นตอนที่ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวท่อนสั้นๆ จะเข้าจับกับบริเวณที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอต้นแบบ และขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (extension) เป็นขั้นตอนที่เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสเติมนิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิดเข้าที่ปลาย 3´ของไพรเมอร์ โดยมีลำดับการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ตามเบสที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอต้นแบบ สายดีเอ็นเอที่ได้จะยาวขึ้น ปฏิกิริยาทั้ง 3 ขั้นตอนจะดำเนินไปตามโปรแกรมจำนวนรอบของอุณหภูมิที่ตั้งค่าไว้ ซึ่งเทคนิคพีซีอาร์ทำให้เกิดเทคนิคใหม่ๆ ทางพันธุศาสตร์โมเลกุล ในการวิเคราะห์จีโนม (ปรีชาประเทพา. 2543 : 45 – 50) เช่น เทคนิคอาร์เอพีดี (RAPD : random amplified polymorphic DNA) เทคนิคเอเอฟแอลพี (AFLP : amplified fragment length polymorphism) เทคนิคเอ็มพี พีซีอาร์ (MP – PCR : microsatellite – primed PCR) เทคนิคไอเอสเอสอาร์ (ISSR : inter simple sequence repeat) เทคนิคเอสอาร์เอพี (SRAP : sequence – related amplified polymorphism) เทคนิคทีอาร์เอพี (TRAP : target region amplification polymorphism) เทคนิคเอสซีเออาร์ (SCAR : sequence characterized amplified region)